اساس کار،کنترل کیفی وکالیبراسیون آنالیزور های خو ن شناسی(قسمت دوم)

اساس کار،کنترل کیفی وکالیبراسیون آنالیزور های خو ن شناسی(قسمت دوم)
ممکن است درکم خونی های الیپتوسیتوزهمولیتیکی وپیروپویییکلوسیتوزارثی وسوختگی حجم متوسط سلولی برخی ازگلبولهای قرمزدرآستانه30 تا50 فمتولیترقرارگیردوهم بجای پلاکت شمرده شوند

گلبولهای شکسته همراه باکاهش پلاکت علامت چند بیماری مهم ازقبیل انعقاد داخل عروقی منتشره( DIC )،ترومبوسیتوپنی ترومبوتیک (TTP)،سندرم همولیتکی اورمیک HUS است اگرتصحیح شمارش پلاکتی آنالیزورکه به علت گلبولهای شکسته افزایش کاذب داردباگستره محیطی چک نشود تمام موارد اورژانس فوق که در صورت عدم تشخیص تهدید مرگ دارند ممکن است تشخیص داده نشوند. برخی ازآنالیزورهای پیشرفته براساسRNA و گرانول که درپلاکت وجود دارد آنها را ازگلبولهای شکسته جدا میکنند؛برای مثال دربرخی آنالیزورها پارامتری بنامPLT-O گزارش میشودکه شمارش واقعی پلاکتها را باسیستم نوری وبراساس گرانولهای موجود انجام داده وآنراازشیزتوسیت بدون گرانول جدا میکند. افزایش نا متناسب ضدانعقاد به نمونه خون موجب تورم پلاکتی میگردد،پلاکت متورم شده با تریکدن وتولیدپاره های پلاکتی موجب میشودکه هرپاره پلاکت بجای پلاکت شمرده شده وموجب افزایش کاذب آن گردد.

ترومبوسیتوپنی کاذب شایعترازترومبوسیتوز کاذب است وازمهمترین علتهای آن حضور ذرات ریز لخته درخون،پدیده اقماری پلاکتها وتجمع خوشه ای شکل پلاکتها ناشی ازفعال شدن آتوآنتی بادیهای پلاکتی درحضورضدانعقاد EDTA است.
پلاکتهادرپدیده اقماری به دور یک نوتروفیل یامنوسیت یا لنفوسیت به واسطه آنتی بادی حلقه زده وتوسط آنالیزورمورد شمارش قرارنمیگیرند پلاکتها درپدیده تجمعی به صورت دستجات چند تایی درسراسرگستره محیطی مشاهده میشوند.هرتجمع توسط آنالیزوربه عنوان یک گلبول سفید شمرده میشود وازاین روموجب افزایش کاذب گلبولهای سفیدوکاهش شمارش پلاکت میگردد. پلاکتهای درشت وژیانت مانند درابتلا به ترومبوسیتوپنی ایمونولوژیک یاسندرم برنارد، آنومالی مایهگلین واختلالات لنفوپرولیفراتیوممکن است درآستانه شمارش گلبول قرمزقرارگرفته وبه عنوان پلاکت شمرده نشوند. میزان حجم متوسط پلاکتی( MPV ) تایک ساعت بعدازنمونه گیری درضد انعقادEDTA افزایش یافته وپس ازآن بین یک تاسه ساعت پایداربوده ودوباره باگذشت زمان افزایش مییابد. آنالیزورهای امپدانس مقدارMPV رابیشتراز آنالیزورهای اپتیک گزارش میک‌ند. تورم پلاکت در EDTA موجب بزرگ شدن اندازه درسیستمهای امپدانس شده درحالی که شفاف شدن سلول براثر تورم موجب کاهش پراکنش نوروگزارش حجم کمتر آن درسیستمهای اپتیکی میشود. رسم خط میانه هیستوگرام حجم پلاکتی را روی محورX درعدد MPV یاحجم متوسط پلاکتی قطع میک‌ند.
میانگین حجم گلبول قرمز (Mean cell volume)
چنانچه یک گلبول قرمز را ازمیان گلبولهای قرمزبدن به عنوان نماینده گلبولها انتخاب کنید وآن را مورد حجم سنجی قراردهید به پارامترحجم متوسط گلبول قرمزیاMCV دست یافته اید. درآنالیزورهای خونشناسی مقدارMCV ازروی هیستوگرام حجم گلبولهای قرمزبدست می آید. هیستوگرام حجم یک منحنی زنگوله ای شکل است که درآن محورy برحسب فراوانی ومحورX برحسب حجم برمبنای فمتولیترتقسیم بندی شده است. رسم خط میانه درهیستوگرام حجم محورX را درمقدارMCV قطع میک‌ند. آنالیزحجم گلبولهای قرمزتوسط256 کانال صورت میگیرد؛بدین مفهوم که اطلاعات دیجیتالی عبورهرسلول ازروزنه توسط تحلیلگرهای ارتفاع پالس پردازش میشودوبدین ترتیب هیستوگرامهای توزیع حجمی گلبولهای قرمزوسفیدوپلاکت ترسيم میگردد. ) 256 کانال تحلیلگرپالس جهت آنالیز و رسم هیستوگرامRBC وWBC و65 کانال تحلیل پالس جهت آنالیز پلاکتها و رسم هیستوگرام آن است(. دامنه پالسهایRBC درمحورX ازحجم35 فمتولیترتا200 فمتولیترقرارمیگیرد. ذرات20 - 2 فمتولیتری به عنوان پلاکت وبزرگتراز36 فمتولیتر به عنوان گلبول قرمزشمارش میشوند. توجه داشته باشید که دامنه وارتفاع پالسهای الکتریکی توسط تحلیلگرها وتبدیل کننده های آنالیزوربرحسب حجم)فمتولیتر( تفسیرشده وهیستوگرام توزیع حجمی ترسیم میگردد. درهرکانال محدوده مشخصی ازارتفاع ودامنه مورد پردازش قرارگرفته واطلاعات بدست آمده ازمجموع256 کانال به صورت هیستوگرام ترسیم میشود.

باهیستوگرام حجم میتوان جمعیت گلبولهای میکروسیت وماکروسیت ویاجمعیت دوشکلی رادرمیان گلبولهای قرمزمشاهده کرد.
برای محاسبه دامنه پراکندگی گلبولهای قرمز خطی که هیستوگرام حجم رادر20 % فراوانی(Frequency) قطع کندمعادل3SD )سه انحراف معیار( درنظرگرفته میشود. پهنای هیستوگرام با رسم این خط برابرRDW یادامنه تغییرات حجم برمبنای انحراف معیاریا standard deviation SD ) )میباشد،سپس مقدارکیSD برMCV تقسیم شده وحاصل درعدد100 ضرب میشودکه نتیجه آن پارامتر RDW برحسبCV یاضریب تغییرات دامنه حجم است که مقدارنرمال آن5/ 14 - 5/ 11 درصد است وبیشتراز5/ 14 درصدبیانگرتغییرات اندازه (anisocytosis) است.
علل افزایش کاذبMCV درآنالیزورها

-1 مانده شدن خونEDTA دار درحرارت اتاق موجب تورم وافزایش6 FL حجم متوسط سلولی در24 ساعت میگردد.
-2 پدیده آگلوتیناسیون سرد با چسباندن گلبولهای قرمزبه یکدیگرموجب افزایشMCV و MCH وMCHC میگردد. مکیروسیتوزشدید با قرار دادن گلبولهای قرمزبسیارکوچک درآستانه شمارش پلاکتی موجب افزایش پلاکت وافزایشMCV به علت حذف گلبولهای کوچک ازجمعیت گلبولهای قرمز وشمارش آنهابجای پلاکت میشود .
-4 لکوسیتوزشدید)بیشتراز30 تا50 هزار( موجب خطا دراندازه گیریMCV میشود. گفتنی است که درحالت نرمال نسبت گلبولهای قرمزبه سفید500 تا700 به یک است وازطرف دیگر به علت رقیق ترشدن سوسپانسیون گلبولهای قرمز، شمارش گلبولهای قرمزتحت اثرتعداد گلبولهای سفید قرارنمیگیرد.
توجه داشته باشید که شمارش گلبولهای قرمزوپلاکت درمحلول ایزوتونیک بدون اضافه کردن محلول لایزینگ صورت میگیرد و افزایش گلبولهای سفیدموجب میشودکه دستگاه در کانالRBC/PLT باشمارش گلبولهای سفید بجایRBC موجب افزایش کاذب حجم متوسط سلول( MCV ) گردد.
-5 کاهش انعطاف پذیری گلبولهای قرمز موجب افزایشMCV میشود. یکی ازپارامترهای مهم درمحاسبه حجم متوسط گلبول درحین عبور ازروزنه،فاکتورشکل ومقدارهموگلوبین گلبول است. گلبولهای غیرسیال مثل اسفروسیت انعطاف پذیرنبوده وبا ایجاد مقاومت بیشتر مورد حجم سنجی بیشتری قرارمیگیرند. گلبولهای قرمزبسیارهایپوکروم به علت کشیده شدن بیشتر درحین عبورازروزنه مورد حجم سنجی کمتری قرارمیگیرند.
-6 پدیده تورم حاد با افزایشMCV وکاهش MCHC همراه است. اینحالت در مواردهیپراسمولاریتی ازقبیل دیابت،اورمی و هیپرناترمی رخ میدهد. برای مثال قند خون بیشتر از400 یا500 میلی گرم دردسی لیتربا نفوذ به درون گلبولهای قرمزموجب هیپراسمولار شدن محیط داخل گلبول میشود. وقتی این گلبولها درمحیط ایزوتونیک دستگاه رقیق میشوند،عبور ناگهانی آب به درون گلبولهاموجب تورم حاد و افزایشMCV میگردد.
-7 رسوب تدریجی پروتئین دراطراف روزنه دستگاه موجب تنگ شدن دریچه وافزایش مقاومت بیشترباعبورسلول ازروزنه تنگ شده میگردد،از اینروشستشوی روزانه دستگاه باشوینده دستگاه (Cell cleaner) که دارای ترکیبات هیپوکلریت سدیم است ضروری است.
-8 افزایش املاح ضدانعقاد با ایجاد محیط هیپراسمولار و یا با چروکیده کردن وبی آب کردن گلبول موجب تغییرات ناگهانی حجم سلول درآنالیزورها میگردند.

درسایتوگرام آنالیزورها ی اپتیک سایتوگرام اریتروسیتی براساسMCV وMCHC به 9 مربع تقسیم شده است. درشرایط نرمال، سایتوگرام اریتروسیتها فقط درمربع وسط قرارگرفته وازروی سایتوگرام پارامترهای توزیع حجم محاسبه میشود.
افتراق سلولها درآنالیزورهای خونشناسی
روش امپدانس الکتریکی قادربه طبقه بندی سلولها براساس تغییرات هدایت درجریان مستقیم الکتریسیته(DC ) است وسلولهای خون دربرابر این امواج مانندعایق بیولوژیک عمل میکنند. در حالی که جریان الکترومغناطیس یا رادیوفرکانس(RF) ازسلول عبورکرده وتحت اثرمحتویات داخل سلول مانندهسته وگرانولها قرارمیگیرد،بابرقراری امواج DC وRF )جریان مستقیم وامواج رادیوفرکانس( بین الکترودهای داخل وخارج درچامبرشمارش میتوان به اطلاعات درونی سلول وحجم آن درحین عبورازناحیه حساس روزنه پی برد. سلولها حین عبورازروزنه موجب تغییرظرفیت)کاپاسیتانس( الکتریکی شده( Electrical capacitance ) که متناسب بامحتویات درون سلولی است. با بکارگیری همزمان تکنولوژی امپدانس وظرفیت الکتریکی به طورهمزمان میتوان طبقه بندی5 قسمتی از لکوسیتها را داشت.

بابکارگیری همزمان امواج الکتریسيته مستقیم وامواج رادیوفرکانس میتوان سلولها راحین عبورازروزنه برای حجم ومحتویات درون سلولی آنالیز وطبقه بندی کرد.
تکنولوژی الکترواپتکیelectro – optic ) )بر اساس واکنش متقابل نوروماده استوار است. هنگامی که یک پرتو نور به سلولی برخورد کند. پدیده های زیرکه هرکدام دررابطه با یک ویژگی ازسلول است رخ میدهد. بازتابش نوردرزاویه تابش( Reflection ) یا پراکنش نوردرزاویه صفردرجه نسبت به نورتابشی دررابطه باحجم واندازه سلول است.
تغییرجهت وشکست نوردرارتباط با محتویات درون سلولی بوده که باسنجش پراکنش نوردرزوایای دیگرصورت میگیرد. (Refraction and diffraction)
نورجذب شده توسط سلول تابع محتویات ویارنگ پذیری سلول برای یک رنگ مخصوص است. بازتابش نورتابشی باطول موج متفاوت )فلوئورسانس( درآنالیزورهای برپایه ی ا صول اپتکی ازپرتو نور لامپ تنگستن– هالوژن ویا یک لیزرمانند لیزرنئون هلیوم استفاده میشود. باتوجه به اینکه نورلیزر مونوکروماتکی)تکرنگ( ودارای حداقل واگرایی است درافتراق سلولهابسیارمناسب است.

بااستفاده ازتکنولوژی اپتیک،اطلاعات هرسلول هنگام عبورازمقابل پرتو نوری از نظر اندازه،وضعیت هسته وگرانولها مورد پردازش قرارمیگیرد. باانتقال داده ها روی محورx وy ویاانتقال سه بعدی داده ها میتوان پراکنش نگارسلول هارا ترسیم کرد. درواقع هرسلول مانند یک نقطه باتوجه به پردازش داده ها دارای ویژگیهای مختلف روی محورهای مختصاتX وY میگردد.
درتکنولوژی اپتیکی سلولهای خونی درمراحل گوناگون بارقیق کننده ها،معرف های لایزینگ، معرفهای رنگ آمیزی،سورفکتانت هاوشوینده هاورنگهای فلورکروم مجاورشده وسپس به صورت سوسپانسیون سلولی درمی آید. سوسپانسیون سلولی به صورت تک ردیف وجریان پیوسته ازلوله باریک شیشه ای کوارتزیا کانال فلوسل عبورمیکند وهر سلول حین عبوربا پرتو لیزری یاغیرلیزری برخورد میکند. آشکارسازهای ویژه جهت اندازه گیری بازتابش نوردرزوایای گوناگون تعبیه شده است. تحلیل اطلاعات آشکارسازها به صورت پراکنش نگارScatter gram ) )روی صفحه مانیتورظاهر میشود. پراکنش نوردرزاویه صفردرجه یا پراکنش درزاویه تابش(Forward scatter ) متناسب با اندازه سلول وپراکنش درزاویه10 درجه با ساختار وپیچیدگی سلول،پراکنش درزاویه90 درجه (Side scatter)با لوبولاریتی سلول وپراکنش نور دپلاریزه درزاویه90 درجه با تعداد ائوزینوفیلهای خون دررابطه است. باتکنولوژی پراکنش نوردر زوایای مختلف برای جداسازی سلولها((MAPSS میتوان به افتراق 5 قسمتی لکوسیتها دست یافت.
دراین تکنولوژی اطلاعات هرسلول هنگام عبور ازمقابل پرتونوری ازنظراندازه،وضعیت هسته وگرانولها مورد پردازش قرارمیگیرد. باانتقال داده ها روی محورx وy ویاانتقال سه بعدی داده ها میتوان پراکنش نگارسلولهاراترسیم کرد. درواقع هرسلول مانند یک نقطه باتوجه به پردازش داده ها دارای ویژگیهای مختلف روی محورهای مختصات X وY میگردد. آنالیزورهای مبتنی برتکنولوژیVCS به صورت همزمان هرسه تکنولوژی امپدانس یاحجم سنجی V))،ظرفیت الکتریکی( C) وتکنولوژی پراکنش نور رابکارمیبرند. پرتونورلیزربه گلبولهای قرمز نه تنها حجم سنجی را انجام میدهد بلکه با سنجش شکست نوردرزاویه15 - 5 درجهت را کم درون سلولی هموگلوبین( MCHC) رامستقیماً بدست می آورد.

سوسپانسیون سلولی به صورت تک ردیف و جریان پیوسته ازلوله باریک شیشه ای کوارتز یاکانال فلوسل عبورمیکندوهرسلول حین عبورباپرتولیزری یا غیرلیزری برخورد میکند.

سنجش مستقیمMCHC رابه صورت حروف معکوسCHCM نشان میدهندومفهوم آن این است که برخلاف سایرآنالیزورها که ازطریق فرمول محاسبه میشود دراینجا به طورمستقیم بدست آمده است. البته آنالیزور،پارامترMCHC رابا فرمول هم محاسبه کرده وباCHCM برای کنترل کیفی مقایسه میکند.درآنالیزورهای تکنکیون با بکارگیری کانال پراکسیدازوکانال بازوفیل،لوبولاریتی گلبولهای سفید ازهم متمایز میشوند.ائوزینوفیل ونوتروفیل ومنوسیت به ترتیب دارای بیشترین خاصیت پراکسیدازدرسیتوپلاسم هستند. گفتنی است که بازوفیلها درPH بسیاراسیدی وائوزینوفیل درpH بسیارقلیایی درمقابل لیز شدن بیشترین مقاومت را دارند،درحالی که بقیه سلولها بسرعت لیزمیشوندوازاین روبراساس حجم سنجی پس ازمجاورت خون باPH اسیدی ویاقلیایی میتوان این دوسلول را ازهم جدا کرد گرانولهای ائوزینوفیل وآلودگی گلبولهای قرمزبا انگل مالاریا موجب دپلاریزه کردن نورشده وراهی برای افتراق ائوزینوفیل واعلام خطربرای انگل مالاریا بازمیکند.

موقعیت انواع لکوسیتهای رسیده ونارس در کانال پراکسیدازHemalog-D
گرانولهای بازوفیل دارای هپارین هستند وبا این ویژگی پذیرای رنگهایی مانندآلسین بلوویا آسترابلو میباشند که باسنجش جذب نورتوسط سلول پس ازرنگ آمیزی میتوان آنها را شناسایی کرد. هنگام کارباآنالیزورها هیچگاه ته مانده های محلولهای قبلی رابه محلول جدیداضافه نکنید. معرفها بایستی دارای سریال ساخت بوده واز شرکتهای معتبرتهیه شوند.

درتکنولوژیMAPSS یاسنجش پراکنش نور پلاریزه درزوایای مختلف میتوان سلولهای خونی راطبقه بندی کرد. گفتنی است که پراکنش نوردپلاریزه درزاویه90 درجه با اعداد ائوزینوفیل ها دررابطه است.
ادامه دارد......
برگرفته از ماهنامه اخبارآزمایشگاهی